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　　知識講解：細胞培養(yǎng)的步驟和注意事項

　　1:細胞復(fù)蘇

　　低溫保存的細胞從液氮中取出后，在37℃的水浴中不斷搖晃，以促進其融化。將解凍后的細胞移入離心管，加入37℃(胎牛血清約10%)預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基中，輕輕吹掃離心，500克離心2分鐘，丟棄上清液。

　　加入DMEM清洗，并丟棄上清液。加入DMEM全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，制成細胞懸液，接種于皿/瓶中，在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　2:細胞通道

　　當細胞密度達到80%～90%(早產(chǎn)不足，細胞條件不好，1:2～1:10或以上比例傳代，一般1:3～1:5細胞發(fā)生，即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間內(nèi)，非細胞有絲分裂的次數(shù))，取出完整培養(yǎng)基，洗滌兩次1x PBS。

　　加入胰蛋白酶(注：消化液覆蓋細胞的最佳量，最佳消化溫度為37℃。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞。如果細胞質(zhì)收縮，細胞不再連接成碎片，說明此時細胞的消化是合適的)，并將其放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3分鐘。

　　加入適量DMEM全培養(yǎng)基停止胰蛋白酶消化，移入離心管離心2分鐘，棄去上清液，然后加入DMEM全培養(yǎng)基洗滌，棄去上清液。

　　加入DMEM全培養(yǎng)基，輕輕吹勻，取10μL計數(shù)，按要求的細胞體積在含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

　　3:細胞冷凍保存

　　當細胞密度達到80%～90%時，去除全培養(yǎng)基，用1x PBS洗滌兩次。加入胰蛋白酶消化，放入細胞培養(yǎng)箱約2-3分鐘。加入DMEM全培養(yǎng)基停止胰蛋白酶消化，移入離心管，離心500g，離心2min，棄去上清液，然后加入DMEM全培養(yǎng)基洗滌，棄去上清液。加入LML凍存液(90%胎牛血清，10%二甲基亞砜)。一般來說，血清含量可以在10%到90%之間調(diào)節(jié)。一方面在凍存液中加入血清可以為細胞提供營養(yǎng)，另一方面可以提供蔗糖、白蛋白等不滲透的保護物質(zhì)，在凍存過程中更好地保護細胞。放入低溫保存管(管內(nèi)加入異丙醇，以保證降溫速度)，立即放入4℃冰箱內(nèi)冷凍30分鐘，然后放入-20℃冰箱30分鐘，再放入-80℃冰箱過夜。

　　第二天放入液氮中，至少可以保存兩年。如果沒有，可以保存三個月。

　　細胞冷凍復(fù)蘇的原理是：緩慢冷凍和快速解凍，這樣更有利于保持細胞的活力。不加任何保護劑的細胞低溫保存會導(dǎo)致細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，引起細胞內(nèi)的機械損傷、滲透壓、pH值和電解質(zhì)的變化，進而導(dǎo)致細胞死亡。

　　4:注意事項

　　(1) 預(yù)熱培養(yǎng)液：將配制好的含培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴中預(yù)熱;

　　(2) 用75%酒精擦拭超凈工作臺和紫外線照射的手;

　　(3) 正確放置使用過的設(shè)備：保證足夠的操作空間，既方便操作又減少污染;

　　(4) 酒精燈：注意火焰不要太小;

　　(5) 嚴格無菌操作;

　　(6) 貼壁細胞的消化是中等的：消化時間受多種因素的影響，如消化液的種類、制備時間和加入培養(yǎng)瓶中的量。在消化過程中，應(yīng)注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化。一旦細胞質(zhì)收縮，連接變松，或有碎片漂浮的跡象，消化應(yīng)立即終止;

　　(7) 傳代細胞的所有操作應(yīng)盡可能靠近酒精燈火焰。最好一次只操作一個電池，每個電池使用一套設(shè)備。避免交叉感染;

　　(8) 每次打開或關(guān)閉細胞瓶口時，都需要在酒精燈上消毒

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